Витамин B6
Исторические сведения
Витамин В6 как самостоятельный, незаменимый пищевой фактор, обнаружен впервые в 1934 году Дьерди. Открытие витамина В6 связано с изучением водорастворимых факторов, предупреждающих развитие дерматита у крыс. Вначале было установлено, что признаки особой формы дерматита конечностей у крыс, названной «акродинией», устраняются при наличии в пищевом рационе водорастворимого фактора, который по свойствам отличается от рибофлавина и никотиновой кислоты, оказывающих положительное действие при лечении дерматита у человека и животных.
Этот фактор, являющийся азотсодержащим основанием, получил название витамин В6. Позднее выяснилось, что витамин В6 идентичен фактору V, антидерматитному фактору, витамину Н и фактору 1, открытым раньше. В 1932 г. Odake впервые выделил из отрубей риса хлоргидрат неизвестного азотистого основания с эмпирической формулой С8 H10NО3, идентичность которого с витамином В6 была установлена позже. Затем одновременно в нескольких лабораториях витамин В6 в кристаллическом виде был получен из дрожжей, рисовых отрубей и других пищевых продуктов. В биологических объектах он находится преимущественно в виде высокомолекулярных комплексов с белками.
Химическая природа витамина В6
В 1939 г. структура витамина В6 как 2-метил-3-окси
4,5-дисоксиметилпи-ридина установлена одновременно в двух лабораториях.
Данная структура витамина В6 подтверждена его синтезом. Исходя из наличия в молекуле витамина В6 пиридинового кольца и гидроксильных групп американские авторы предложили название «пиридоксин». Этот термин вытеснил более раннее наименование «адермин», предложенное немецкими исследователями, поскольку дерматиты у крыс не строго специфичны как проявление недостаточности витамина В6. После обнаружения альдегидного и аминного аналогов витамина Вб комитет по номенклатуре Американского института питания рекомендовал для них названия «пиридоксаль» и «пиридоксамин». Согласно опубликованным в 1970 г. рекомендациям Международной комиссии по номенклатуре биологической химии, все производные 3-оксипиридина с витаминной активностью имеют общее (родовое) название «витамин В6», а производное с ОН-группой в положения 4 пиридинового ядра называют «пиридоксин» или «пиридоксол».Snell (1944) обнаружил в моче животных биологически активный продукт превращения пиридоксина, названный им псевдопиридоксином. Установлено, что для некоторых молочнокислых бактерий псевдопиридоксин обладает активностью ростового фактора, в несколько тысяч раз большей по сравнению с пиридоксином. В то же время по отношению к дрожжам и крысам с В6-авитаминозом (по активности) псевдопиридоксин аналогичен пиридоксину Природа псевдопиридоксина выяснена в дальнейших исследованиях, показавших, что этот продукт представляет собой смесь двух производных пиридоксина—пиридоксаля и пиридоксамина, имеющих в положении 4 альдегидную или, соответственно, аминную группу. Структура пиридоксаля и пиридоксамина точно установлена в 1944 г.
Пиридоксаль обладает повышенной активностью для Lactobacillus casei, a пиридоксамин — в отношении Streptococcus faecalis. При обработке пиридоксина окислителями (например, перманганатом калия) в мягких условиях происходит образование пиридоксаля. Накопление пиридоксамина наблюдалось при автоклавировании пиридоксина с аммиаком, аминокислотами. Установлено, что при нагревании с глютаминовой кислотой и другими аминокислотами пиридоксаль превращается в пиридоксамин, а последний переходит в пиридоксаль при нагревании с кетокислотами (например, с альфа-кетоглютаровой). В основе процессов взаимопревращения пиридоксаля и пиридоксамина лежит реакция неферментативного переноса NН2-группы — переаминирования. Аналогичные превращения пиридоксаль — пиридоксамин осуществляются в организме ферментативным путем. Подробно превращения пиридоксина изложены ниже.
Как показали результаты дальнейших исследований, основной метаболически активной формой витамина В6 является фосфорный эфир пиридоксаля — пиридоксаль-5-фосфат. Ограниченной биологической активностью обладает пиридоксамин-5-фосфат, принимающий участие только в реакциях переаминирования.Структура пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата окончательно установлена лишь в 1952 г., хотя коферментные функции этих производных витамина В6 в превращениях аминокислот доказаны значительно раньше.
Метаболиты и аналоги витамина В6
Huff и соавт. (1944) впервые обнаружили в моче крыс флюоресцирующее вещество, имеющее отношение к уровню потребления витамина В6. Это соединение, получившее название 4-пиридоксиловой кислоты, выделено из мочи животных и идентифицировано как метаболит витамина В6. Хотя пиридоксиловая кислота— конечный продукт обмена всех форм витамина В6, непосредственным предшественником ее в организме является только пиридоксаль. Вследствие этого образованию пиридоксиловой кислоты из других форм витамина B6 должно предшествовать превращение их в пиридоксаль. В моче животных и человека пиридоксиловая кислота выделяется преимущественно в форме лактона. 4- Пиридоксиловая кислота не стимулирует рост микроорганизмов, но 4-пиридоксолактон у некоторых микроорганизмов обладает незначительной биологической активностью.
Со времени открытия витамина В6 синтезированы многочисленные аналоги различных форм витамина и исследована их биологическая активность. При изучении антидерматитного действия ряда аналогов пиридоксина на крысах установлено, что 4,5-диацетил- и 3,4,5-триацетил пиридоксин по биологической активности не уступают пиридоксину, в то время как 3-и 4-метиловые эфиры пиридоксина в опытах на крысах имели только 10% его активности. При замещении 4-оксигруппы пиридоксина атомом водорода получено производное—З-окси-5-оксиметил-2,4-диметилпиридин, известный как 4-дезоксипиридоксин. Этот аналог и 4-метоксипиридоксин являются антагонистами витамина В6.
При введении их различным животным и человеку наблюдаются симптомы В6-витаминной недостаточности, исчезающие после введения пиридоксина. Среди известных аналогов витамина В6 одним из наиболее сильных антивитаминов является 2-этил-3-амино-4-этоксиметил-5- аминометилпиридин. Аналогами витамина В6, обладающими антивитаминными свойствами, являются также изоникотинилгидразид и токсопиримидин. Большинство аналогов являются конкурентными ингибиторами, но некоторые обладают также свойствами каталитически активных заменителей пиридоксальфосфата.
Физические и химические свойства витамина В6
Все формы витамина В6 (пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин) реагируют как основания с кислотами, образуя соли. Хлоргидрат пиридоксина образует бесцветные пластинчатые кристаллы, плавится при 204—206° (с разложением). Кристаллы свободного пиридоксина имеют температуру плавления 160°. Хлоргидрат пиридоксина хорошо растворим в воде (1 г в 4,5 мл), труднее—в спирте (1 г в 90 мл) и ацетоне, нерастворим в эфире и хлороформе. Он обладает горьковато-кислым вкусом. Все формы витамина Вб по сравнению с другими витаминами комплекса В отличаются относительно большей стабильностью. Это обстоятельство, по-видимому, позволило за сравнительно короткий срок после открытия витамина В6 выделить его в кристаллическом виде и осуществить синтез. Установлено, что пиридоксин-хлоргидрат не разрушается при нагревании в 5 н. растворах кислоты или щелочи.
Пиридоксамин обладает аналогичной стабильностью, однако нагревание пиридоксаля в щелочной среде приводит к частному разрушению. Фосфорные эфиры пиридоксаля и пиридоксамина в кислой среде подвергаются гидролизу, причем гидролиз протекает с максимальной скоростью только в интервале рН 1,5—2,0. Упомянутые производные витамина Вб стабильны при автоклавировании в 2 н. растворе H2SO4. В этих условиях фосфорные эфиры пиридоксаля и пиридоксамина гидролизуются с отщеплением остатка фосфорной кислоты. Все формы витамина В6 резистентны к действию кислорода воздуха.
Однако, при действии некоторых окислителей, например при нагревании с азотной кислотой, а также в присутствии перманганата калия или перекиси водорода при комнатной температуре все они окисляются до пиридоксаля. В этих условиях пиридоксаль и пиридоксаль-5-фосфат частично превращаются в 4-пиридоксиловую кислоту. Все производные витамина В6 высокочувствительны к действию света, особенно при нейтральных и щелочных значениях рН. В кислых растворах при рН 1,0- они более резистентны к действию света. Растворы пиридоксаля и пиридоксальфосфата при щелочных значениях рН окрашены в желтый цвет, в то время как другие производные витамина В6 в этих условиях бесцветны.
Производные витамина В6 как свободные, а также связанные с белками в виде пиридоксалевых ферментов, имеют характерные спектры поглощения и флюоресценции, величины и интенсивность которых изменяются в зависимости от изменения концентрации водородных ионов. Например, в водных растворах при рН 2,1 пиридоксин имеет в спектре поглощения один максимум при 291 нм, а при рН 6,6 два максимума— при 255 и 326 нм. Наблюдаемые характерные изменения в спектрах поглощения объясняются равновесиями ионизационных форм и наличием таутомерных превращений в кислом, нейтральном и щелочном растворе, которые свойственны производным витамина В6.
При облучении ультрафиолетовыми лучами различные формы витамина В6 проявляют способность к флюоресценции, различающейся по характеру, интенсивности и цвету. Например, пиридоксин и пиридоксамин обладают синей флюоресценцией, а пиридоксаль—голубой, изменяющийся до желтой при щелочных значениях рН. Интенсивность флюоресценции фосфорных эфиров пиридоксаля и пиридоксамина ниже флюоресценции нефосфорилированных форм.
Представляют интерес реакции взаимодействия С-О-группы пиридоксаля и пиридоксальфосфата с карбонильными реагентами—гидроксиламином, фенилгидразином и др. При взаимодействии с пиридоксалевыми ферментами карбонильные реагенты вызывают быстрое их инактивирование путем связывания С=О-группы пиридоксальфосфата. Пиридоксаль и пиридоксальфосфат при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином образуют соответствующие гидразоны, различающиеся по свойствам.
В процессе взаимодействия с аминокислотами или аминами пиридоксаль и пиридоксальфосфат обратимо реагируют с их NН2
группами с образованием альдиминов (азометинов) или шиффовых оснований. Некоторые 1,2- и 1,3-аминотиолы (цистеин, пенициллаламин, гомоцистеин и др.) взаимодействуют с пиридоксалем и его производными, образуя соответствующие относительно прочные тиазолидиновые производные.
Методы определения витамина В6
Определение витамина В6 в биологическом материале представляет трудности ввиду наличия нескольких форм витамина, обладающих биологической активностью, но различающихся по свойствам.
Все известные в настоящее время методы определения витамина В6 можно разделить на:
- химические и физические;
- ферментативные;
- микробиологические;
- хроматографические;
- электрофоретические.
Колориметрические методы
Разработан ряд колориметрических методов определения пиридоксина и его производных, основанных на способности их образовывать окрашенные комплексы с различными соединениями. Они используются для определения витамина В6 в растворах, а также для идентификации различных форм его после разделения методами хроматографии и электрофореза на бумаге. К методам этой группы относятся, например, реакции на фенольный гидроксил. В присутствии хлорного железа и реактива фолина витамин В6 образует окрашенные продукты. Колориметрические методы с использованием диазотированных растворов сульфаниловой кислоты, п-нитроанилина, 2,6-дихлорхинонхлоримида или п-аминоацетофенона зависят от присутствия в молекуле витамина В6 фенольного гидроксила в п-положении. Из методов этой группы наиболее широко, особенно в сочетании с хроматографией и электрофорезом, используются реакции с дихлорхинон-хлоримидом, преимущественно с пиридоксином, при которой появляется синее окрашивание (проба Гиббса). Разработаны колориметрические методы, связанные с наличием формильной группы в положении 4 у пиридоксаля и пиридоксальфосфата. В этом случае для получения окрашенных комплексов используют ряд реактивов: м-оксипропадрин, этаноламин, тиофен, фенилгидразин. Wada и Snell (1961) разработали количественный метод раздельного определения пиридоксаля и пирлдоксальфосфата в биологическом материале, определяя их в виде фенилгидразонов. Образование циангидрина при взаимодействии цианистого калия с формильной группой пиридоксальфосфата используют в одном из спектро-фотометрических методов его определения.
Спектрофотометрические методы
Известно, что все формы и производные витамина В6 имеют характерные спектры поглощения, претерпевающие сдвиги при изменениях рН и других воздействиях. По характеру спектра при различных значениях рН пиридоксальфосфат значительно отличается от других форм витамина В6. При рН 7,0 все формы витамина В6 имеют два максимума поглощения. Для каждой формы витамина B6 определены коэффициенты молярной экстинкции, позволяющие при различных значениях рН рассчитать их количественное содержание. При исследовании спектров пиридоксалевых ферментов обнаружено наличие у большинства из них максимума поглощения в области 410—430 нм, характерного для пиридоксальфосфата, связанного с NН2-группой апофермента. Изучение изменений спектров поглощения высокоочищенных препаратов различных пиридоксалевых ферментов в присутствии субстратов и ингибиторов нашло широкое применение при выяснении механизмов их действия, а также характера связи кофермента с апоферментами.
Флуорометрические методы
Флуорометрические методы определения витамина В6 основаны на измерении флюоресценции раствора непосредственно при освещении его лучами с определенной длиной волны либо после предварительного превращения витамина В6 в производное, обладающее более высокой степенью флюоресценции (например, 4-пиридоксиловая кислота и ее лактон; циангидрин пиридоксаля). Флуорометрические методы отличаются высокой чувствительностью, превышающей в 10—100 раз чувствительность колориметрических и спектрофотометрических определений. Использование спектрофлуориметров позволит точно измерять избирательное поглощение и определять максимальную интенсивность флюоресценции, что позволяет определять витамин В6 в концентрации 0,002 мкг/мл и выше. Huff и соавт.(1944) показали, что 4-пиридоксиловая кислота—продукт обмена витамина В6 обладает характерной флюоресценцией. При нагревании пиридоксиловой кислоты в кислой среде происходит превращение ее в соответствующий лактон, обладающий сильной голубой флюоресценцией, по интенсивности значительно (примерно в 25 раз) превосходящей флюоресценцию кислоты.
Ферментативные методы
Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина — пиридоксальфосфата и пиридоксаминофосфата, присутствующих в исследуемом материале, с апоферментами некоторых пиридоксалевых ферментов. В определенных интервалах скорости ферментативных реакций пропорциональны концентрации исследуемых коферментов. Впервые для определения пиридоксальфосфата в биологическом материале использован апофермент тирозиндекарбоксилазы Str. faecalis, выращенного на синтетической среде, лишенной витамина В6. Позже для этой цели был предложен апофермент триптофаназы из Е. coli, полученный в условиях, обеспечивающих максимальную диссоциацию кофермента. Наиболее чувствительным методом является определение фосфорилированных форм витамина В6. с помощью апофермента аспартаттрансаминазы, полученного из дрожжей. Этот метод позволяет определять до 0,00001 мкг/мл суммы пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата.
Микробиологические методы
При изучении биологической роли витамина В6, в частности как ростового фактора для микроорганизмов, установлено, что в нем нуждаются главным образом молочнокислые бактерии и дрожжи. Различные формы витамина В6 одними и теми же микроорганизмами используются по-разному Это дало возможность разработать методы дифференциального микробиологического определения различных форм витамина В6, используя молочнокислые бактерии и дрожжи. Поскольку микроорганизмы в противоположность животным для роста могут использовать только свободные, не связанные с белками формы витамина В6, перед применением микробиологических методов исследуемый образец необходимо подвергать автоклавированию в кислой среде. Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis способны использовать для роста в одинаковой степени пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин, поэтому дрожжевой метод нашел применение для количественного определения суммарного содержания витамина В6 в исследуемом материале.
Методы хроматографии и электрофореза
Известен ряд методов разделения производных витамина В6 на колонках с ионообменным смолами, а также путем хроматографии на бумаге с последующим определением в виде окрашенных комплексов или по интенсивности флюоресценции. Для определения различных форм витамина В6 предложен метод электрофореза на бумаге, разработанный для чистых растворов. Ряд авторов применили этот метод для качественного определения производных витамина В6 в моче. Попытка использовать его для количественного и дифференцированного определения витамина В6 в моче и крови встречает ряд трудностей.
Распространение витамина В6 в природе
Cодержание в основных пищевых продуктах
Витамин В6 синтезируется многочисленными видами микроорганизмов и зелеными растениями. Микроорганизмы кишечника жвачных животных активно синтезируют его; эти животные не нуждаются во введении витамина В6 с пищей. Микрофлора кишечника человека также синтезирует витамин В6, но в недостаточных количествах, поэтому для человека и большинства животных основным источником витамина являются продукты питания. Особенно велика потребность в витамине В6 при приеме некоторых антибиотиков, подавляющих рост кишечной микрофлоры.
Хотя изучению биохимии витамина В6 посвящено большое количество исследований, до последнего времени нет данных относительно путей его биосинтеза в организме, в частности о характере предшественника его пиридинового кольца.
Витамин В6 имеет широкое распространение в природе. Он найден у различных микроорганизмов, в тканях животных и растений. По характеру распространения он значительно отличается от других витаминов группы В. Наиболее богатыми источниками витамина В6 являются сухие пивные дрожжи, мясо, рыба, цельное зерно злаков и особенно отруби злаков. У животных много витамина B6находится в ткани печени, сердца, почек. В овощах и молочных продуктах содержится мало витамина В6. Относительно высокое количество витамина найдено в горохе, бобах. Из фруктов по содержанию витамина В6 выделяются бананы (до 4 мкг/г). Свежий зеленый перец особенно богат одной из форм витамина В6. пиридоксамином (53 мкг/г). При определении микробиологическим методом содержания различных форм витамина В6 в тканях животных установлено, что до 80% общего количества витамина В6 приходится на долю пиридоксаля и пиридоксамина.
Распространение пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата в природе отражает распространение пиридоксалевых ферментов, которые присутствуют главным образом в тканях с энергичным обменом веществ—печени, почках, сердце, а также найдены в дрожжах и у бактерий. У теплокровных животных наибольшим резервом витамина В6, медленно мобилизуемым при его недостаточном содержании в пище, является пиридоксальфосфат, входящий в состав фосфорилазы скелетной и сердечной мускулатуры и других органов.
Содержание витамина В6 и его отдельных форм в пищевых продуктах изменяется в процессе приготовления пищи. При варке мяса теряется до 20% витамина В6. Для большинства других продуктов потери витамина В6 при этом составляют до 20—35°/ , для некоторых— до 70%. При замораживании тех же продуктов и длительном хранении в замороженном состоянии потери витамина В6 незначительны. При обдирке и разломе зернопродуктов и приготовления муки теряется до 80—90% витамина В6. Это связано с удалением в процессе помола отрубей, богатых витамином В6. При выпечке хлеба потери витамина В6 составляют от 3,5 до 17,5%.
Обмен витамина В6
Наличие методов дифференциального определения витамина В6 позволило более тщательно исследовать обмен различных его форм. В литературе мало данных относительно превращения витамина В6. Он быстро всасывается из кишечника и подвергается дальнейшим превращениям в тканях организма.
Введенный витамин В6 выделяется с мочой главным образом в виде его метаболитов (пиридоксиловая кислота и ее лактон; шиффовы основания пиридоксаля) спустя 2—4 часа после введения. При этом в моче обнаружены лишь незначительные количества свободного пиридоксина и других форм витамина. Как уже указывалось, конечным продуктом обмена всех форм витамина В6 является 4-пиридоксиловая кислота, выведение которой с мочой (в сумме с лактоном) составляет от 70 до 90% введенного витамина В6.После нагрузки животных и человека пиридоксином, меченным радиоизотопами в «физиологических» дозах, обнаружено появление в моче также 5-фосфсфного эфира 4-пиридоксиловой кислоты—продукта прямого окисления пиридоксальфосфата.
После введения пиридоксамина, помимо пиридоксиловой кислоты и неизмененного амина, с мочой выделяется пиридоксаль, У людей, находящихся в условиях повышенной температуры и влажности, различные метаболиты витамина В6, помимо мочи, найдены в поте.
Превращения витамина В6
Обмен витамина В6 в организме тесно связан, с процессами биосинтеза и диссимиляции пиридоксальфосфата, основной коферментной формы витамина В6, входящей в состав различных ферментных систем. Известно, что сам пиридоксин не обладает активностью как кофактор метаболизма; его следует рассматривать как провитамин. Путем ряда ферментативных реакций пиридоксин превращается в организме в биологически активные формы витамина В6 — пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат.
Фермент, участвующий в реакции фосфорилирования пиридоксаля за счет АТФ—пиридоксалькиназа, найден в различных тканях.животных и у микроорганизмов. Пиридоксалькиназа активно фосфорилирует и другие формы витамина В6—пиридоксамин и пиридоксин. При этом образуются соответственно пиридоксаминфосфат и пиридоксинфосфат. В печени и других тканях крыс также наблюдается превращение пиридоксина в пиридоксаль в процессе окисления пиридоксиноксидазой. Однако активность последней в тканях крыс незначительна. В то же время альдегидоксидаза печени не способна окислять пиридоксинфосфат Процесс окисления пиридоксаминфосфата в пиридоксальфосфат, сопровождающийся освобождением аммиака, впервые наблюдался в присутствии препаратов печени крыс и кролика. Скорость этого окисления экстрактами печени и мозга кроликов значительно выше по сравнению с окислением соответствующих недофосфорилированных прозводных—пиридоксина и пиридоксамина. Очищенный препарат пиридоксинфосфатоксидазы получен из печени кроликов. Сродство оксидазы к пиридоксинфосфату в несколько раз превышает сродство к пиридоксаминфосфату. Свободный пиридоксальфосфат, являющийся продуктом реакции, оказывает на фермент, сильное тормозящее влияние. Простетической группой оксидазы является флавинмононуклеотид. Высокая активность пиридоксинфосфатоксидазы обнаружена в печени, почках и ткани мозга животных, а также у многих микроорганизмов. Из вышеуказанного следует, что биосинтез пиридоксальфосфата в организме может осуществляться либо путем фосфорилирования пиридоксаля при участии пиридоксалькиназы, либо путем фосфорилирования пиридоксина и пиридоксамина и последующего окисления их пиридоксинофосфатоксидазой.
Взаимопревращения пиридоксаля и пиридоксамина и их фосфорных эфиров осуществляются в организме в реакциях переаминирования в активном центре аминотрансфераз. Установлено, что пиридоксалькиназа и пиридоксинфосфатоксидаза обладают относительно низкой степенью сродства к пиридоксамину и пиридоксаминфосфату и высоким сродством к пиридоксину и его фосфорному эфиру. Считается установленным, что пиридоксамин используется для синтеза пиридоксальфосфата в меньшей степени. Превращение всех форм витамина В6 в организме приводит к образованию 4-пиридоксиловой кислоты, выделяющейся с мочой. Предшественником ее является только пиридоксаль, окисляющийся до пиридоксиловой кислоты при участии относительно активной альдегидоксидазы печени и других органов. Процессу превращения пиридоксальфосфата в пиридоксиловую кислоту должно предшествовать его дефосфорилирование, происходящее при участии фосфатаз.
Роль витамина В6 в обмене веществ
Коферментные функции витамина В6
В настоящее время доказано, что производные большинства водорастворимых витаминов—рибофлавина, тиамина, никотиновой, фолиевой и пантотеновой кислот, биотина, а также витамина В6—входят в состав простетических групп многих важных клеточных ферментов, осуществляющих различные превращения веществ в организме животных, растений и у микроорганизмов. Установлена важная и разнообразная роль витамина В6 в процессах азотистого обмена.
В 1945—1947 гг. ряд авторов обнаружили, что пиридоксаль-5-фосфат является необходимым кофактором или простетической группой ряда аминокислотных декарбоксилаз, участвующих в образовании аминов и аминокислот. Одновременно обнаружены коферментные функции пиридоксальфосфата в действии различных трансаминаз, катализирующих процессы трансаминирования аминокислот. В последующие годы число вновь открытых пиридоксалевых ферментов быстро увеличивалось. В приведенном ниже списке, перечислены некоторые важнейшие процессы обмена (главным образом обмена аминокислот), в которых установлено участие витамина В6:
1. Трансминирование альфа, бета, гамма и дельта-аминокислот и аминов.
2. Рацемизация аланина (и некоторых других альфа-аминокислот).
3. альфа-Декарбоксилирование многих аминокислот.
4. бета-Декарбоксилирование аспарагиновой кислоты.
5. Дезаминирование серина, треонина и гомосерина (неокислительное).
6. Десульфирование цистеина.
7. Синтез и распад цистатионина.
8. Превращение триптофана до индола, пирувата и NН3
9. Превращение тирозина до фенола, пирувата и NH3.
10. Превращение аллиина до аллицина, пирувата и NH3.
11. Синтез триптофана из индолилглицерофосфата и серина.
12. Распад кинуренина до антраниловой кислоты и аланина.
13. Синтез цистеина из серина и H2S.
14. Синтез S-метилцистеина из серина и метилмеркаптана.
15. Распад треонина до ацетальдегида и глицина.
16. Взаимопревращение глицина и серина.
17. Синтез 5-аминолевулиновой кислоты из глицина и сукцинил-коэнзима А.
18. Синтез сфингозина из серина и пальмитил-коэнзима А.
Как видно из этого далеко не полного списка, среди других известных коферментов пиридоксальфосфат выделяется исключительным разнообразием ферментных реакций, протекающих при его участии. В процессе установления коферментных функций пиридоксальфосфата показано, что у многих пиридоксалевых ферментов получение апоферментов обычными методами, используемыми в энзимологии для этой цели, затруднительно вследствие прочной связи пиридоксальфосфата с белком. Отделение кофермента в ряде случаев сопровождается необратимым инактивированием апофермента. В связи с этим установление роли пиридоксальфосфата в действии исследуемого фермента с использованием его апофермента возможно лишь для тех пиридоксалевых ферментов, у которых пиридоксальфосфат относительно легко диссоциирует.
Поскольку функциональной группой пиридоксалевых ферментов является альдегидная группа кофермента, их активность нарушается в присутствии связывающих карбонильную группу реагентов—гидроксиламина, изоникотинилгидразида и др. Чувствительность исследуемого фермента к такого рода ингибиторам являлась признаком, указывающим на возможное присутствие в нем пиридоксальфосфата. Для решения вопроса об участии пиридоксальфосфата в действии фермента использовали также животных с В6-авитаминозом и культуры некоторых микроорганизмов, не обладающих способностью синтезировать витамин В6 (Str. faecalis), выросших на средах без витамина В6. Если в тканях животных с дефицитом витамина B6 или у микроорганизмов активность исследуемого фермента значительно снижена и восстанавливается при введении животным пиридоксина или при добавлении пиридоксальфосфата к экстрактам из тканей В6-дефицитных животных, то это указывает на вероятное участие пиридоксальфосфата в действии данного фермента. Для прямого доказательства функций пиридоксальфосфата как кофермента служит определение количественного содержания пиридоксальфосфата в высокоочищенных препаратах ферментов. В последние годы исследование оптических свойств высокоочищенных препаратов пиридоксалевых ферментов используют не только для установления природы их кофермента, но также при исследовании их взаимодействия с субстратами и ингибиторами и выяснении характера связей апофермента с коферментом.
Прямое участие витамина В6 в процессах превращения аминокислот впервые было показано при изучении альфа-декарбоксилаз L-аминокислот из клеток бактерий и животных тканей. Путем соответствующей обработки бактериальных декарбоксилаз тирозина, орнитина, лизина и глютаминовой кислоты получены апофермекты, активность которых восстанавливалась в присутствии известного ранее кофермента, выделенного в виде концентрата из дрожжей и получившего название кодекарбоксилазы. Одним из характерных свойств кодекарбоксилазы была чувствительность к ядам, действующим на карбонильную группу. После осуществления в 1945 г. синтеза фосфорного эфира пиридоксаля установлена его идентичность с природной кодекарбоксилазой. Позднее функции пиридоксальфосфата как кофермента доказаны у декарбоксилаз различных аминокислот, обнаруженных в тканях животных, растений и у бактерий. К их числу относятся декарбоксилаза глютаминовой кислоты, найденная в ткани мозга животных и у микроорганизмов, при действии которой образуется гамма-аминомасляная кислота, а также декарбоксилаза цистеинсульфиновой кислоты, участвующая в синтезе таурина. У некоторых микроорганизмов, например у Pseudornycobacterium n. sp. и других видов, обнаружен фермент, специфически декарбоксилирующий L-аспарагиновую кислоту в бета-положении с образованием альфа-аланина, также являющийся пиридоксальфосфатсодержащим ферментом.
На основании данных о возможности взаимопревращения пиридоксаля и пиридоксамина в реакциях неферментативного переаминирования, было высказанопредположение о возможном участии такой реакции в качестве промежуточного этапа в процессе биологического переаминирования аминокислот, открытого А. Браунштейном и М. Г. Крицман в 1937 г. Это предположение вскоре было подтверждено. У крыс с недостаточностью витамина В6 находили снижение аспартаттрансаминазы в тканях. Снижение активности этой трансаминазы (аминотрансферазы) наблюдали также в клетках Str faecalis, выросших на средах с низким содержанием витамина В6. Активность алофермента трансаминазы Str. faecalis, полученного путем диализа, восстанавливалась в присутствии пиридоксальфосфата. Идентичность простетической группы аспартат-трансаминазы с кодекарбоксилазой и пиридоксальфосфатом установлена для препарата фермента из тканей животных. Оказалось, что пиридоксаминфосфат наряду с пиридоксальфосфатом способен восстанавливать активность аспартаттрансаминазы, однако присоединение к апоферменту при определенных условиях опыта происходит значительно медленнее у первого.
В ходе исследования основных процессов азотистого обмена, в частности процессов трансаминирования, и основываясь на данных относительно обратимости действия глютаматдегидрогеназы, А. Е. Браун штейн в 1939 г высказал гипотезу об участии реакций переаминирования в качестве промежуточного звена в процессах окислительного дезаминирования альфа-аминокислот при их синтезе из NНз и альфа-кетокислот. Согласно этой гипотезе, совместное действие трансаминаз и глютаматдегидрогеназы у всех организмов обеспечивает освобождение аммиака и образование кетокислот в процессе дезаминирования альфа-аминокислот, а также синтез альфа-аминокислот из кетокислот и аммиака.
В связи с обнаружением участия витамина В6 в процессах переаминирования в качестве простетической группы трансаминаз доказано, его исключительно важное значение в процессах азотистого обмена в целом. Ввиду ошибочного представления об ограниченности числа аминокислот, используемых в реакциях переаминирования, ведущее значение реакций переаминирования в процессах обмена азотистых соединений в первое время не получило признания. Обнаружение широкого участия почти всех аминокислот, а также амидов—глютамина и аспарагина как субстратов в реакциях переаминирования изменило первоначальные представления об ограниченном значении процессов переаминирования в азотистом обмене. Изучение роли глютаминовой и аспарагиновой кислот и глютамина в процессах биосинтеза мочевины, пуриновых и пиримидиновых оснований показало, что реакции переаминирования играют также первостепенную роль в образовании главных вторичных и конечных продуктов азотистого обмена.
Вслед за изложенными выше данными обнаружены многочисленные специфические функции витамина В6 в превращениях отдельных аминокислот. Витамин В6 принимает участие в синтезе и расщеплении триптофана у микроорганизмов, а именно в действии триптофансинтетазы (у Neurospora), осуществляющей синтез L-триптофана из индола и серина. Доказано также участие пиридоксальфосфата в функции триптофаназы у Е. coli, при действии которой из триптофана образуются индол, пируват и аммиак. Участие витамина В6 в обмене триптофана у млекопитающих предполагалось в связи с обнаружением в моче животных при недостаточности витамина В6 ксантуреновой кислоты—одного из продуктов обмена триптофана. Одновременно обнаружено, что при недостаточности витамина В6 у млекопитающих нарушен процесс образования никотиновой кислоты из L-триптофана, проявляющийсд уменьшением количества выделяемых с мочой, никотиновой кислоты и ее производных, а также снижением содержания никотинамидаденин-динуклеотидов в эритроцитах крови.
В 1949 г. выяснена конкретная роль витамина В6 в .процессе превращения L-триптофана у млекопитающих. Оказалось, что при недостаточности витамина В6 в организме нарушается активность кинурениназы, осуществляющей гидролитическое расщепление главного продукта обмена триптофана—кинуренина, протекающее с образованием аланина и антраниловой кислоты. Кинурениназа участвует также в аналогичном превращении 3-окси-кинуренина в 3-оксиантраниловую кислоту, являющуюся предшественником никотиновой кислоты. Роль витамина В6 в обмене триптофана у животных не исчерпывается участием его в кинурениназной реакции. Пиридоксалъфосфат является также простетической группой трансаминазы кинуренина, обнаруженной в тканях животных и у Neurospora, при действии которой на кинуренин и 3-оксикинуренин в присутствии кетокислот образуются кинуреновая и ксантуреновая кислоты.
Известно, что серусодержащие аминокислоты и продукты их обмена играют важную роль в организме, входя в состав различных белков, ферментов и многих соединений, обладающих биологической активностью. Среди серосодержащих аминокислот центральное место в процессах обмена занимает L-цистеин. Ряд новых коферментных функций витамина В6 обнаружен при исследовании превращений серосодержащих и оксиаминокислот. Одним из основных итогов этих исследований явилось установление участия пиридоксальфосфата в синтезе L-цистеина в процессе пересульфирования в качестве простетической группы цис татионин-бета-синтазы и цистатионазы (цистатионин-гамма-лиазы). Одновременно была доказана роль пиридоксальфосфата в действии некоторых ферментов, осуществляющих процессы десульфирования цистеина, некоторых его аналогов и гомоцистеина, а именно цистеиндесульфгидразы, гомоцистеиндесульфгидразы, цистеинлиазы, трансминазы цистеина, серинсульфгидразы, аллииназы.
На основании близкого структурного сходства и характера превращений оксиаминокислот и серосодержащих аминокислот А. Е. Браунштейн в 1949 г. высказал предположение об участии витамина В6 в неокислительном дезаминировании и других превращениях бета- и гамма-оксиаминокислот. Функции витамина В6 в превращениях оксиаминокислот установлены путем обнаружения участия пиридоксальфосфата в действии дезаминаз (дегидратаз) L-треонина и L-серина, а также гомосерина у микроорганизмов и животных. Кроме того, выявилось участие пиридоксальфосфата в процессах ферментативного расщепления углеродной цепи оксиаминокислот—серина, треонина, аллотреонина, фенилаланина и других—с разрывом связи 2С—ЗС и образованием глицина и соответствующих альдегидов. Наряду с этим доказана роль пиридоксальфосфата в синтезе серина из глицина и одноуглеродного фрагмента, а также в действии некоторых других ферментов, участвующих в синтезе оксиаминокислот у микроорганизмов и животных.
В процессе исследования потребностей в витамине В6 у некоторых молочнокислых бактерий при культивировании их на синтетических средах обнаружена заменимость витамина В6 D-аланином. В дальнейшем было отмечено, что наблюдаемые взаимоотношения между D-аланином и витамином В6 связаны с участием пиридоксальфосфата в действии рацемазы аланина, участвующей в образовании необходимого этим бактериям D-изомера. Функции пиридоксальфосфата как кофермента рацемаз глютаминовой кислоты и метионина доказаны у ряда микроорганизмов.
Вопрос о роли витамина В6 в реакциях окислительного дезаминирования аминов долгое время оставался нерешенным. Первоначально предположение об участии витамина В6 в окислительном дезаминировании гистамина и диаминов возникло в связи с высокой чувствительностью диаминоксидазы и некоторых аминоксидаз к карбонильным реагентам. Однако по химическим и спектральным свойствам очищенные препараты аминоксидаз значительно отличались от других пиридоксалевых ферментов. Как выяснилось в последние годы, причиной этих различий является присутствие в активном центре этих ферментов наряду с пиридоксальфосфатом двухвалентной меди, причем оба кофактора прочно связаны с апоферментом.
Одну из важных функций в обмене аминокислот пиридоксальфосфат осуществляет в процессе синтеза гема в эритроцитах птиц на стадии конденсации глицина и активного сукцината (сукцинил-S-KoA). В этой реакции образуется (возможно, через альфа-амино-бета-кетоадипиновую кислоту) дельта-аминолевулиновая кислота— предшественник порфириновых пигментов. Нарушение синтеза дельта -аминолевулиновой кислоты является, видимо, одной из основных причин развития анемии, возникающей у человека и животных при недостаточности витамина В6. В аналогичной реакции при участии пиридоксальфосфатсодержащего фермента синтезируется дегидросфингозин.
В последние годы активно изучается роль пиридоксальфосфата в действии фосфорилазы, играющей, как известно, центральную роль, в обмене гликогена в организме. Существует предположение, что в фосфорилазе пиридоксальфосфат выполняет не каталитическую, а скорее структурную функцию, участвуя в ассоциации четырех белковых субъединиц, образующих молекулу фосфорилазы А. Однако некоторые новые данные указывают на наличие прямого взаимодействия пиридоксальфосфата в активном центре фермента с ионогенными субстратами (неорганический фосфат, глюкозо-1-фосфат) и на возможную каталитическую роль его в действии фосфорилазы.
В ранних исследованиях по выяснению роли витамина В6 в обмене веществ установлено, что у крыс отсутствие полиненасыщенных жирных кислот (линоленовой и др.) в пище вызывало симптомы, во многом сходные с симптомами авитаминоза- В6 (остановка роста, падение веса, развитие эритроэдемы). Включение в рацион жиров, содержащих ненасыщенные жирные кислоты и витамин B6, полностью снимало явления недостаточности. Ненасыщенные жирные кислоты оказывали у животных «сберегающее» действие на потребность в пиридоксине. По данным некоторых авторов, крысы, получающие диету одновременно недостаточную по витамину В6 и ненасыщенным жирным кислотам, синтезировали меньше арахидоновой кислоты по сравнению с контрольными животными, получающими пиридоксин или диету, недостаточную только по «незаменимым» полиненасыщенным жирным кислотам. На основании этих данных предполагалось, что основная роль витамина В6 в обмене жиров связана с превращениями полиненасыщенных жирных кислот. Однако в дальнейшем это предположение не было подтверждено. Таким образом, конкретная, роль витамина В6 в обмене жиров остается невыясненной. Предполагаемые механизмы участия витамина В6 в обмене холестерина также не нашли конкретного подтверждения.
Общая теория пиридоксалевого катализа
По мере накопления данных относительно каталитической роли пиридоксальфосфата в превращениях аминокислот возникал вопрос о причинах необычайно разносторонней реакционной активности пиридоксальфосфата, выражавшейся в действии различных пиридоксалевых ферментов. Объяснение этих причин было дано А. Е. Браунштейном и М. М. Шемякиным, разработавшим в 1952 г. общую теорию пиридоксалевого катализа. Согласно этой теории, «общей причиной является способность С-О-группы пиридоксальфосфата, находящегося в ферментах, взаимодействовать с NН2-группами субстратов с образованием соответствующих промежуточных соединений—азометинов. У образующихся азометинов происходит резкое изменение характера альфа-углеродного атома. Это обусловлено смещением электронов в молекуле азометинов, возникающим вследствие наличия сильных электроноакцепторных заместителей в альфа-положении и под влиянием внешних условий. По химическим свойствам образующиеся азометины значительно отличаются от исходных альфа-аминокислот и близки к соответствующим им альфа -кетокислотам. Вследствие этого азометины, аналогично альфа -кетокислотам, легко могут вступать в реакции различного рода, типичные для альфа- кетокислот. Значение теории пиридоксалевого катализа Браунштейна-Шемякина состоит в том, что она не только объяснила с единой точки зрения механизм всех превращений аминокислот при участии пиридоксалиевых ферментов, но и позволила предсказать новые коферментные функции пиридоксальфосфата в обмене аминокислот, которые впоследствии были доказаны экспериментальным путем. В дальнейшем эта теория была полностью подтверждена и получила общее признание. Роль функциональных групп специфических белков (апоферменты), от структуры которых зависит направление реакций, катализируемых отдельными пиридоксалевыми ферментами, стала доступной прямому экспериментальному изучению только в последние годы, по мере получения этих ферментов в высокоочищенной форме и разработки физических и химических методов их исследования.
Взаимодействие витамина B6 с другими витаминами и биологически активными соединениями
При изучении ферментных систем, катализирующих синтез пиридоксаль- фосфата в организме , установлено, что активность одного из основных ферментов этого процесса — оксидазы пиридоксин- и пиридоксамин-фосфата — чувствительна к недостатку рибофлавина в питании. При исследовании очищенных препаратов этого фермента, полученных из печени кролика, выяснилось, что его простетической группой является производное витамина В2 — флавинмононуклеотид. У крыс, содержавшихся на диете, дефицитной по витамину В2, с добавкой больших количеств жирных кислот (вызывающих состояние В2 -авитаминоз) наблюдались снижение активности этой оксидазы.
Большой интерес представляют результаты исследований, в которых было обнаружено участие пиридоксальфосфата в синтезе КоА. Содержание КоА снижено в печени В6- авитаминозных крыс аналогично животным с дефицитом пантотеновой кислоты. Пониженный синтез КоА в печени животных с дефицитом витамина В6 восстанавливался при добавлении пиридоксальфосфата в опытах in vitro. Эти данные свидетельствуют об участии витамина наряду с пантотеновой кислотой в синтезе КоА. Необходимо указать также на участие пиридоксальфосфата в синтезе сфингозина в ткани мозга. Получены данные о связи между витамином В6 и витамином В12. Установлено, что при дефиците витамина В6 у крыс уменьшено (в 2 раза) время всасывания из кишечника витамина В12, меченного кобальтом, а также отложение витамина В12 в печени и содержание его в плазме крови. Конкретная роль витамина В6 в этих процессах не выяснена.
Способы определения обеспеченности организма человека витамином В6
Определение пиридоксиловой кислоты в моче используется многими исследователями для установления состояния обмена витамина В6 в организме. Обычно считается, что для здорового человека норма выделения этого метаболита составляет до 3—5 мг в сутки. Однако эти количества подвержены значительным колебаниям и зависят от уровня белкового питания и общего состояния организма.
При недостаточности витамина В6 суточное выделение пиридоксиловой кислоты составляет 1—2 мг и меньше. Определение количества выделяемой пиридоксиловой кислоты дает лишь приближенное представление о состоянии обмена витамина В6, поскольку у людей, находящихся в аналогичных условиях питания, имеются большие индивидуальные колебания в выведении кислоты с мочой. Косвенным методом определения витамина В6 является так называемая ксантуреновая проба, довольно широко применявшаяся клиницистами. Впервые ксантуреновая кислота—продукт обмена триптофана найдена в моче В6-гиповитаминозных крыс после нагрузок триптофаном.
Свойство ксантуреновой кислоты давать ярко-зеленое окрашивание с ионами железа в растворе бикарбоната положено в основу метода количественного определения ее в моче. Выделение ксантуреновой кислоты с мочой у здорового человека в среднем составляет до 15 мг в сутки. При недостаточности витамина В6, а также при некоторых заболеваниях, сопровождающихся нарушением обмена витамина В6, количество выделяемой ксантуреновой кислоты после нагрузки 10 г триптофана повышается и составляет 10—200 мг. Однако в некоторых случаях, несмотря на недостаточность витамина В6, ксантуреновая кислота не выделяется.
При рассмотрении схемы превращений триптофана ясно, что недостаточность витамина В6 связана со снижением активности кинурениназы, приводящим к накоплению субстратов этого фермента— кинуренина и 3-оксикинуренина. Эти соединения являются также субстратами фермента кинуренинтрансаминазы, участвующего в образовании ксантуреновой кислоты. Поскольку кинуренинтрансаминаза является также пиридоксалевым ферментом, можно было ожидать снижения ее активности при недостаточности витамина В6. Однако сродство пиридоксальфосфата к апоферменту в кинуренинтрансаминазе значительно выше, чем в случае с кинурениназой, поэтому при развитии недостаточности витамина В6 в первую очередь снижается активность кинурениназы, а образование ксантуреновой кислоты вначале даже несколько повышено вследствие значительного повышения концентрации в тканях 3-оксикинуренина. У крыс активность кинурениназы в печени в 4 раза выше, чем в почках, а кинуренинтрансаминаза сосредоточена главным образом в печени. Если учесть, что при развитии авитаминоза запас витамина В6 снижается первоначально в печени, то это вызывает в первую очередь снижение активности кинурениназы. Показано также, что кинурениназа и трансаминаза кинуренина различаются по внутриклеточной локализации: кинурениназа находится главным образом в растворимой части клетки, тогда как большая часть трансаминазы связана с митохондриями. Истощение запасов витамина В6 в организме при далеко зашедшем авитаминозе приводит также к снижению активности кинуренинтрансаминазы, сопровождающемуся уменьшением выделения ксантуреновой кислоты.
Данные, полученные в последние годы, показали, что у крыс при недостаточности витамина В6 повышено выделение с мочой щавелевой кислоты. Оказалось, что в этом случае источником щавелевой кислоты является глиоксиловая кислота—продукт превращения глицина, образование которой значительно повышается при недостаточности витамина В6.
Известно, что соли щавелевой кислоты откладываются в почках и мочеточниках, образуя оксалатные камни. Количественное измерение выделения щавелевой кислоты с мочой применяется как один из косвенных критериев для оценки обеспеченности организма витамином В6. Одним из условий, предотвращающих отложение солей щавелевой кислоты, считается снабжение организма достаточными количествами витамина В6.
Недостаточность витамина В6 в питании животных и человека вызывает снижение концентрации всех форм витамина В6 в тканях организма. Определение суммарного содержания витамина В6 и особенно пиридоксальфосфата в крови может служить одним из приемов обнаружения недостаточности витамина В6 у человека и животных. Для этой цели используют флюорометрические, ферментативные и микробиологические методы, позволяющие количественно и дифференциально оценивать наличие биологически активной формы витамина В6 в норме и при патологических состояниях. Установлено, что у крыс при недостаточности витамина В6 содержание его снижается в первую очередь в ткани печени и почек по сравнению с другими органами.
Содержание животных на диете с недостаточным количеством витамина В6 в ряде случаев приводит к быстрому падению активности некоторых пиридоксалевых ферментов в тканях. Например, у крыс, получавших В6-дефицитную диету, содержащую 40% белка, в течение 7— 10 дней, в печени отмечалось значительное снижение активности цистатионазы и декарбоксилазцистеиновой кислоты, О-тирозина и 5-окси-триптофана.
В опытах in vitro добавление пиридоксальфосфата к экстрактам из тканей животных с В6-витаминной недостаточностью не приводило к восстановлению активности указанных ферментов. В этом случае дефицит витамина В6 в организме вызывал нарушение активности некоторых пиридоксалевых ферментов, связанное, по-видимому с инактивированием их апоферментов.
По данным Greengard и Gordon (1963), введение витамина В6 животным стимулирует синтез апофермента тирозинтрансаминазы —одного из пиридоксалевых ферментов. По мнению авторов, количество пиридоксальфосфата внутри клетки является также регулятором синтеза специфических белков пиридоксалевых ферментов.
Потребности человека в витамине В6
Проявление В6-витаминной недостаточности
Определить суточную потребность в витамине В6 у человека трудно, поскольку значительное количество витамина синтезируется бактериями кишечного тракта. Для более точной оценки этой потребности используют подавление антибиотиками кишечной флоры, синтезирующей витамин В6 (и ряд других витаминов, которые, естественно, должны включаться в состав контрольного синтетического рациона). Необходимо учитывать, что недостаточность в витамине В6 может развиваться при различных кишечных инфекциях и других заболеваниях, сопровождающихся поносом, а также при введении в организм лекарственных веществ, например антагонистов пиридоксина и некоторых антибиотиков.
Потребность в витамине В6 у человека долгое время была неизвестна ввиду отсутствия специфических симптомов В6—недостаточности, а также наличия многих внутренних и внешних факторов, влияющих на потребность. Однако при некоторых условиях питания, а также при введении антагонистов пиридоксина , у человека появлялись признаки недостаточности витамина В6. Так, у 2 добровольцев, получавших в течение 2 месяцев В6 — дефицитную диету, наблюдались нарушения умственной деятельности и депрессия. У 2 детей с гидроцефалией, психически неполноценных, получавших в течение 76-130 дней диету, дефицитную по витамину В6, отмечались остановка роста, развитие гипохромной анемии, а также снижение выделения с мочой пиридоксиловой кислоты до 0,2-2 мкг в день. При введении больным витамина В6 наблюдаемые симптомы быстро исчезали и обмен приходил к норме.
Явление недостаточности витамина В6 отмечены у людей, получавших внутри мышечно дезоксипиридоксин по 60-150 мг в день. У большинства исследованных, находившихся на диете с дефицитом витамина В6 , а также на полноценной диете, через 3-22 недели после введения дезоксипиридоксина наблюдались потеря аппетита, появление сонливости и тошноты, развитие сухого себорейного дерматита, хейлоза, конъюктивита, глоссита и стоматита. Указанные симптомы исчезали через 2-3 дня после ежедневного введения витамина В6 в количестве 5 мг. У большинства пациентов с признаками недостаточности витамина В6 реакция на выделение ксантуреновой кислоты была отрицательной. Основной причиной этого является, по-видимому, острый недостаток витамина в организме, приводящий к значительному снижению активности кинуренинтрансаминазы —фермента, непосредственно участвующего в образовании ксантуреновой кислоты. У больных лимфосаркомой и лейкемией после введения им дезоксипиридоксина возникали аналогичные признаки недостаточности витамина В6 , устраняемые лишь инъекциями витамина В6.
Экзогенная и эндогенная недостаточности витамина В6
Экзогенная недостаточность витамина В6 связана с низким содержанием его в потребляемой пище и устраняется при дополнительном введении витамина. На основании данных, показавших широкое участие витамина В6 в разнообразных процессах азотистого обмена, можно было ожидать, что при некоторых физиологических состояниях организма, сопровождающихся интенсивным синтезом и распадом белка, расход витамина повышен. В этих случаях, например при беременности, развивается относительная эндогенная недостаточность витамина В6 в материнском организме. О развитии эндогенной недостаточности витамина В6, связанной с нарушением процессов обмена, сказано выше.
В настоящее время накоплен большой экспериментальный и клинический материал, доказавший, что нарушение биосинтеза пиридоксальфосфата в организме имеет важное практическое значение для медицины. Известно, что введение животным некоторых антагонистов витамина В6—дезоксипиридоксина, изоникотинилгидразида, антибиотика циклосерина, пеницилламина, токсопиримидина вызывает явления недостаточности витамина В6, сопровождающиеся снижением активности пиридоксалевых ферментов и уменьшением содержания пиридоксальфосфата в тканях . Некоторые из перечисленных антагонистов витамина В6, например изоникотинилгидразид и циклосерин, широко применяются в клинике при лечении туберкулеза. Пеницилламин может образовываться в организме из пенициллина, а также используется при лечении болезни Вильсона (гепатолентикулярная дегенерация). Токсопиримидин обнаружен в моче человека после массивных нагрузок витамином B1. Он образуется из тиамина некоторыми бактериями кишечника.
Многочисленные данные свидетельствуют о том, что структурные аналоги витамина В6, присутствуя в организме, вызывают нарушение процесса биосинтеза пиридоксальфосфата. Это действие аналогов связано в первую очередь с ингибированием активности пиридоксалькиназы, поскольку некоторые из них являются конкурентными ингибиторами этого фермента, другие под действием той же киназы, подвергаясь фосфорилированию, превращаются в аналоги пиридоксальфосфата и проявляют свойства конкурентных ингибиторов пиридоксинфосфатоксидазы. На активность ферментных систем, участвующих в биосинтезе пиридоксальфосфата, также оказывают действие некоторые производные карбонильных реагентов.
Данные, полученные в последнее время, показывают, что карбонильные реагенты связывают пиридоксаль и пиридоксальфосфат и выводятся из организма в форме гидразонов. Кроме того, гидразоны пиридоксаля обладают в 100 — 1000 раз большим сродством к пиридоксалькиназе по сравнению с пиридоксином или пиридоксалем и при очень низких концентрациях вызывают торможение активности киназы. Обнаруженное торможение играет существенную роль в возникновении эндогенной недостаточности витамина В6 у человека при введении фармакологических препаратов, являющихся карбонильными реагентами или их предшественниками. На скорость биосинтеза пиридоксальфосфата влияют также гормональные воздействия, некоторые физиологические состояния и нарушения обмена веществ. При беременности и введении гонадотропного гормона активность пиридоксальфосфатоксидазы возрастает; при этом повышается содержание пиридоксальфосфата в тканях. Тиреотоксикоз, а также адренал- и гипофизэктомия вызывают снижение уровня пиридоксальфосфата. Все указанные факторы, вызывающие развитие экзогенной и эндогенной недостаточности витамина В6 , приводят к значительному нарушению обмена веществ в организме.
Токсичность витамина B6
Согласно данным литературы (Robinson, 1966), витамин В6 относится к малотоксичным веществам.
В последние годы витамин В6 широко используется как терапевтическое средство при различных заболеваниях, причем в ряде случаев в больших концентрациях и длительное время. При исследовании действия на людей высоких доз витамина В6 (50 — 200 мг), введенных внутривенно, внутри мышечно, внутри брюшинно, а также внутрь, в течение нескольких месяцев не наблюдалось токсического действия. Заслуживают внимания данные исследований, проведенных в последнее время на собаках. Введение собакам витамина В6 в количестве 100 и 200 мг/кг в течение 2 месяцев вызывало значительные изменения в крови в соотношении белковых фракций, а также изменения активности некоторых ферментов. Данные гистохимических анализов тканей подопытных животных свидетельствовали об определенных структурных нарушениях печени у собак, получающих высокие дозы витамина В6. Приведенные данные указывают на возможность неблагоприятных воздействий витамина В6 при введении чрезмерно больших доз и продолжительное время. Эти результаты должны учитываться при назначении терапии с использованием витамина В6.
Нарушения обмена витамина В6 при некоторых заболеваниях
Несмотря на большое количество биохимических исследований, посвященных выяснению конкретной роли витамина В6 в отдельных процессах обмена веществ, патофизиологическое значение этого витамина в организме в ряде случаев остается неясным. В настоящее время накоплен большой клинический материал, свидетельствующий о нарушениях обмена витамина В6 при различных заболеваниях. Механизм этих нарушений является предметом интенсивного изучения во многих лабораториях различных стран.
Исходя из чисто эмпирических данных, витамин В6 применяли при лечении тошноты и рвоты беременных женщин. В 1949 г. впервые было показано наличие явлений недостаточности витамина В6 у женщин, страдающих ранними токсикозами беременности. При введении таким пациенткам аланина наблюдалось резкое повышение концентрации мочевины в крови, устраняемое введением витамина В6.. У большинства из 100 обследованных беременных женщин в моче после нагрузки триптофаном обнаружено количество ксантуреновой кислоты, превышающее 190 мг, что указывало на развитие у них дефицита витамина В6. Эти данные подтверждены в дальнейшем. Максимальное выделение ксантуреновой кислоты в ходе беременности находили на 12—14-й неделе беременности. Одновременно у беременных снижалось выделение пиридоксиловой кислоты с мочой. У некоторых из обследованных женщин было понижено также содержание витамина В6 в лейкоцитах и плазме крови. В то же время некоторые авторы не наблюдали повышенного выделения ксантуреновой кислоты с мочой у женщин, особенно в случаях токсикозов второй половины беременности. На основании этих данных оспаривалось наличие нарушений обмена витамина В6 при беременности. Однако дальнейшие исследования показали, что при далеко зашедшем авитаминозе В6 у беременных женщин образование ксантуреновой кислоты из триптофана нарушено. В моче методом хроматографии на бумаге обнаружено повышенное выделение других продуктов неполного распада триптофана—кинуренина, 3-оксикинуренина и их N-ацетилпроизводных, что связано с нарушением активности кинурениназы. Введение витамина В6 беременным женщинам в дозе 2,5—15 мг ежедневно быстро устраняет нарушения обмена триптофана, а также снимает явления токсикозов первой половины беременности—тошноту, рвоту, зуд кожи, дерматит, нарушения деятельности нервной системы и др. Витамин В6 оказался неэффективным при лечении токсикозов второй половины беременности, имеющих другой патогенез. Необходимо отметить, что лечение витамином В6 беременных женщин с токсикозами нормализует в первую очередь выделение ксантуреновой кислоты, в то время как выведение других метаболитов триптофана остается достаточно высоким. Возможно, что это зависит от имеющихся при беременности изменений гормональной регуляции обмена триптофана.
Исследования показали, что и при нормальной беременности организм матери находится в условиях повышенной потребности в витамине В6, которая, по данным некоторых авторов, связана с активным переносом витамина из материнской крови через плаценту в кровь и ткани развивающегося плода. Однако при назначении лечебных доз витамина В6 беременным женщинам необходимо проявлять некоторую осторожность. Витамин В6 способствует повышению содержания серотонина в крови матери и соответственно в плаценте и крови плода. Известно, что серотонин оказывает неблагоприятное действие на питание плаценты и в опытах на животных вызывает нарушения в развитии зародыша. Эти данные необходимо учитывать, избегая назначения беременным женщинам чрезмерно высоких доз (выше 25 мг) витамина В6.
Участие витамина В6 в процессе кроветворения у людей вначале предполагалось на основании данных о благоприятном действии его при лечении некоторых форм анемий. Впервые развитие микроцитарной гипохромной анемии, сопровождающейся нарушением обмена триптофана, обнаружено у 8-летнего мальчика. Введение витамина В6 в процессе лечения анемии нормализовало процесс кроветворения и обмен триптофана.
В 1956 г. в литературе был описан 25-летний мужчина с анемией, не поддававшейся лечению различными терапевтическими средствами. Благоприятное действие на больного оказывало введение витамина В6 в количестве 200 мг ежедневно. В течение относительно короткого времени (4—5 дней) витамин В6 вызывал повышение содержания гемоглобина в крови, нормализацию процесса кроветворения и уменьшение выделения с мочой продуктов обмена триптофана. Однако форма и размер эритроцитов, которые были нарушены при заболевании, после введения витамина В6, полностью не нормализовались. В результате тщательного 9-летнего обследования этот больной был признан «прототипом» анемии, излечивающейся витамином В6. Это заключение основывалось на данных о благоприятном действии витамина В6 на явления микроцитарной анемии и нарушения обмена триптофана аналогично симптомам, наблюдаемым у животных при недостаточности витамина В6. Необходимо указать, что это—один из неоднократно описанных случаев врожденной, резко повышенной (во много раз) потребности в витамине В6 у людей. Это явление можно объяснить генетически обусловленным пороком в синтезе ферментов, участвующих в превращении витамина в кофермент—пиридоксальфосфат. Изучение нарушений эритропоэза, сопровождающихся развитием недостаточности витамина В6, показало, что у отдельных больных имеются некоторые вариации симптомов заболевания, но у большинства—нарушения в обмене железа (следствие нарушения порфириногенеза).
Нарушение обмена витамина В6 у человека отмечено также в случае гипопластических анемий, которые сопровождаются нарушением обмена триптофана. Введение такого рода больным пиридоксина в большинстве случаев оказывало благоприятное действие. У детей развитие гипохромных анемий в некоторых случаях сопровождалось повышенным выделением с мочой ксантуреновой кислоты и уменьшением выделения пиридоксиловой кислоты, что указывало на развитие недостаточности витамина В6. Аналогичный дефицит витамина В6 у детей обнаружен при лейкозах и лимфогранулематозе. Механизм развития анемий, излечивающихся витамином В6, не установлен. Предполагают, что это связано с ролью пиридоксальфосфата в синтезе порфирина в митохондриях—местах, где осуществляется синтез дельта-аминолевулиновой кислоты из глицина и сукцината.
В 1951—1954 гг. в США отмечено значительное число нарушений обмена у детей, находящихся на искусственном вскармливании. Основная диета этих детей состояла из жидкой молочной смеси, в состав которой входило обезжиренное разбавленное коровье молоко, подвергнутое автоклавированию, растительные и животные жиры и некоторые витамины. Нарушения обмена проявлялись судорогами. Длительное содержание детей на такой диете приводило к задержке роста и изменению форменных элементов крови, а также сопровождалось развитием гастроэнтероколитов. Причиной нарушения обмена было низкое содержание витамина В6 в рационе (около 6 мкг на 100 мл смеси). При введении детям витамина В6 судороги быстро исчезали.
Описаны случаи ненормально высокой потребности в витамине В6 у новорожденных детей. У таких детей наблюдались частые судороги, сопровождающиеся резкими изменениями электроэнцефалограммы. При внутримышечном введении высоких доз витамина В6 (100 мг) все явления быстро исчезали. Если для здорового ребенка норма потребления витамина В6 составляет 0,3 мг в день, то детям с врожденной потребностью в этом витамине необходимо ежедневно вводить 50—80 мг пиридоксина. Тщательное обследование новорожденных с повышенной потребностью в витамине В6 показало, что изменение у них физиологической активности центральной нервной системы связано с В6-гиповитаминозом, возникающем вследствие нарушения обмена самого витамина. В некоторых случаях это определено генетическими факторами. Механизм нарушений физиологической активности мозга при дефиците в организме витамина В6 полностью не выяснен.
Нарушения обмена витамина В6 обнаружены также при заболеваниях печени. В настоящее время нет точных данных, объясняющих взаимоотношения обмена витамина В6 и заболеваний печени. Некоторые авторы склонны считать, что одним из важных факторов в развитии заболеваний печени при недостаточности витамина В6 является изменение обмена белка. У больных эпидемическим гепатитом ряд авторов обнаружили дефицит витамина В6, проявляющийся нарушением обмена триптофана (положительная ксантуреновая проба) и снижением выделения пиридоксиловой кислоты. У них выявлена также недостаточность в никотиновой кислоте, зависящая от тяжести заболевания. Клинические наблюдения, свидетельствующие о повышенном выделении у таких больных продуктов неполного обмена триптофана-3-оксикинуренина и 3-оксиантраниловой кислоты наряду с ксантуреновой кислотой, дают основание предполагать снижение активности кинурениназы, связанное с нарушением обмена витамина b6. Введение витамина В6 больным гепатитом вызывало нормализацию обмена триптофана и улучшение клинической картины заболевания.
Витамин В6 наряду с другими лекарственными соединениями используют в клинике для профилактики и лечения радиационных поражений. В латентный период витамин В6 улучшает течение и исход заболевания. В острый период радиационного поражения введение витамина В6 в некоторых случаях может вызвать ухудшение общего состояния. Витамин В6 эффективен при лечении осложнений, возникающих в результате рентгенорадиотерапии у больных злокачественными заболеваниями. Механизм противолучевого действия витамина В6 связывают с его стимулирующим действием на гемопоэз и положительным влиянием на активность гистаминазы.
Суточная профилактическая доза витамина В6 для взрослого человека составляет 2 мг, лечебная доза — 25-50 или 100 мг в день. При беременности лечебная доза не должна превышать 10-15 мг (см. выше). Витамин В6 выпускают в виде порошков и таблеток для приема внутрь. В случае затруднений приема препаратов витамина внутрь (при токсикозах беременности и других состояниях) его вводят подкожно, внутри мышечно или внутривенно в количестве 0,3 мг в день и более. Для этой цели используют стерильные растворы витамина В6, выпускаемые в ампулах по 1 мл.
Автор статьи: доцент кафедры биохимии МБФ РГМУ, к.м.н. Адрианов Николай Владимирович.
Специально для ООО «Электронная Медицина».