Метод идентификации витамина с
Кислотные свойства [1,18,19, 28,29]:
Кислотные свойства аскорбиновой кислоты используют для испытания подлинности. После добавления карбоната натрия в водном растворе происходит образование ионизированной формы кислоты аскорбиновой. К полученной натриевой соли прибавляют железа (II) сульфат. Появляется темно-фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием железа аскорбината, исчезающего после добавления разведенной серной кислоты:
Восстановительные свойства [1,18,19, 28,29]:
1. При взаимодействии кислоты аскорбиновой с раствором нитрата серебра его катион восстанавливается до металлического серебра (реакция образования «серебряного зеркала»):
2. Восстановительными свойствами кислоты аскорбиновой обусловлено превращение окрашенного в синий цвет 2,6-дихлорфенолидиндофенола в бесцветное лейкосостояние:
3. Аскорбиновая кислота легко окисляется раствором йода согласно уравнению:
4. При взаимодействии кислоты аскорбиновой с раствором калия перманганата наблюдают обесцвечивание раствора калия перманганата вследствие восстановления марганца до Mn 2+
Физико-химическими методами
Анализ ИК-спектров водорастворимых витаминов
На рис. 3 в качестве примера представлен ИК-спектр кислоты аскорбиновой. В изучаемых спектрах полосы около 2955, 2924, 2855 см ?1 соответствуют валентным колебаниям нС-Н, 1462, 1378 и 722 см ?1 — деформационным колебаниям дС-Нвазели-нового масла. Полосы с частотами около 2361, 2346, 2334 и 666 см ?1 соответствует колебаниям присутствующего в атмосфере углекислого газа.
На основании анализа спектров субстанции кислоты аскорбиновой были выделены следующие характеристических полосы поглощения:нС=О в г-бутиролактоне (1755 см ?1 ), нС=С (1675 см ?1 ),нas(С-О-С) (1322 см ?1 ) и нs(С-О-С) (1026 см ?1 ).
Рис. 3. ИК-спектр субстанции кислоты аскорбиновой в вазелиновом масле.
Рис. 4. ИК-спектр таблеток Аскорбиновая кислота с глюкозой (Фармстандарт-Уфа-ВИТА, Россия) после проведения экстракции спиртом 96%.
В работе был составлен атлас ИК-спектров субстанций и препаратов водорастворимых витаминов с целью их последующего использования в качестве стандартных. Таким образом, разработаны методики подтверждения подлинности кислоты аскорбиновой в таблетках методом ИК-спектроскопии, которые могут быть использованы для выявления фальсифицированных препаратов, содержащих указанное вещество.
Идентификация и дискриминация кислоты аскорбиновой методом БИК-спектроскопии
На рис. 5 представлены БИК-спектры субстанций кислоты аскорбиновой разных производителей с фальсификатом. Видно, что гранулят 97% отличается от порошкообразных субстанций только по интенсивности спектров. Методика сравнения БИК-спектров может использоваться для установления подлинности препаратов только с концентрацией кислоты аскорбиновой в препарате свыше 25-30%. В этом случае в БИК-спектре можно увидеть полосы действующего вещества (рис. 6).
Рис. 5. БИК-спектры субстанций кислоты аскорбиновой 13 серий 8 производителей в сравнении с фальсифицированным образцом
Рис. 6. БИК-спектры субстанции и таблеток с концентрацией кислоты аскорбиновой от 25,16% до 66,67%.
Анализ УФ-спектров кислоты аскорбиновой
Наличие сложных сопряженных систем в структурах водорастворимых вита-минов дает возможность широкого применения УФ-спектрофотометрии для их фармакопейного анализа. IP и USP регламентируют при установлении подлинности сравнение УФ-спектров испытуемой субстанции со спектрами стандартных образцов. ГФ, CP, EP (BP) и JP при установлении подлинности регламентируют сравнение УФ-спектров испытуемой субстанции со стандартными спектрами (рис. 7).
Рис. 7. УФ-спектр кислоты аскорбиновой (15 мкг/мл) в растворе кислоты серной 0,005 М
4. Способы идентификации аскорбиновой кислоты
4.1. Химическими методами.
4.1.1. Кислотные свойства [1,18,19, 28,29]:
Кислотные свойства аскорбиновой кислоты используют для испытания подлинности. После добавления карбоната натрия в водном растворе происходит образование ионизированной формы кислоты аскорбиновой. К полученной натриевой соли прибавляют железа (II) сульфат. Появляется темно-фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием железа аскорбината, исчезающего после добавления разведенной серной кислоты:
ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА [1,18,19, 28,29]:
При взаимодействии кислоты аскорбиновой с раствором нитрата серебра его катион восстанавливается до металлического серебра (реакция образования «серебряного зеркала»):
Восстановительными свойствами кислоты аскорбиновой обусловлено превращение окрашенного в синий цвет 2,6-дихлорфенолидиндофенола в бесцветное лейкосостояние:
Аскорбиновая кислота легко окисляется раствором йода согласно уравнению:
При взаимодействии кислоты аскорбиновой с раствором калия перманганатанаблюдают обесцвечивание раствора калия перманганата вследствие восстановления марганца до Mn 2+
Анализ ИК-спектров водорастворимых витаминов
На рис. 3 в качестве примера представлен ИК-спектр кислоты аскорбиновой. В изучаемых спектрах полосы около 2955, 2924, 2855 см −1 соответствуют валентным колебаниям νС-Н, 1462, 1378 и 722 см −1 – деформационным колебаниям δС-Нвазели-нового масла. Полосы с частотами около 2361, 2346, 2334 и 666 см −1 соответствует колебаниям присутствующего в атмосфере углекислого газа.
На основании анализа спектров субстанции кислоты аскорбиновой были выделены следующие характеристических полосы поглощения:νС=О в γ-бутиролактоне (1755 см −1 ), νС=С (1675 см −1 ),νas(С-О-С) (1322 см −1 ) и νs(С-О-С) (1026 см −1 ).
Рис.3. ИК-спектр субстанции кислоты аскорбиновой в вазелиновом масле.
Рис.4. ИК-спектр таблеток Аскорбиновая кислота с глюкозой (Фармстандарт-Уфа-ВИТА, Россия) после
Проведения экстракции спиртом 96%.
В работе [] был составлен атлас ИК-спектров субстанций и препаратов водорастворимых витаминов с целью их последующего использования в качестве стандартных. Таким образом, разработаны методики подтверждения подлинности кислоты аскорбиновой в таблетках методом ИК-спектроскопии, которые могут быть использованы для выявления фальсифицированных препаратов, содержащих указанное вещество.
4.2.2. Идентификация и дискриминация кислоты аскорбиновой методом бик-спектроскопии
На рис.5 представлены БИК-спектры субстанций кислоты аскорбиновой разных производителей с фальсификатом. Видно, что гранулят 97% отличается от порошкообразных субстанций только по интенсивности спектров. Методика сравнения БИК-спектров может использоваться для установления подлинности препаратов только с концентрацией кислоты аскорбиновой в препарате свыше 25-30%. В этом случае в БИК-спектре можно увидеть полосы действующего вещества (рис. 6).
Рис.5. БИК-спектры субстанций кислоты аскорбиновой 13 серий 8 производителей в сравнении с фальсифицированным образцом.
Рис.6. БИК-спектры субстанции и таблеток с концентрацией кислоты аскорбиновой от 25,16% до 66,67%.
Кислота аскорбиновая (витамин С)
Кислота аскорбиновая (витамин С) Acidum ascorbinicum
До 1912 г. не знали, что тяжелое заболевание цинга вызвано недостатком витамина С, хотя уже в конце XIX века русский врач В. В. Пашутин высказывал мысль о том, что цинга возникает вследствие недостатка в организме какого-то очень важного вещества. В 1922 г. Н. А. Бессонов выделил из капусты кристаллическое вещество, излечивающее цингу, а в 1928 г. венгерский ученый Сент-Дьордьи выделил из коры надпочечнико» вещество кислого характера с резко выраженными восстанавливающими свойствами и молекулярной массой, равной 176.
Поскольку это вещество также излечивало цингу, оно было’ названо кислотой аскорбиновой (от лат. «скорбут» — цинга).
При доказательстве структуры кислоты аскорбиновой было* установлено, что она способна образовывать тетраметиловый 1 эфир, что говорит о наличии четырех гидроксилов в ее молекуле; при каталитическом гидрировании кислоты аскорбиновой поглощается один моль водорода, что подтверждает наличие одной двойной связи в ее молекуле. Было установлено также, что молекула кислоты аскорбиновой имеет характер лактон-ного кольца.
Все эти данные привели к выводу, что кислота аскорбиновая по своей структуре является ^-лактоном-2,3-дегидрО’Ь-гула-новой кислоты.
В 1933 г. был осуществлен синтез кислоты аскорбиновой, который подтвердил ее строение. В промышленности синтез кислоты аскорбиновой осуществляется из D-глюкозы, которая
а больших количествах получается при расщеплении крахмала •серной кислотой.
В молекуле кислоты аскорбиновой имеется два асимметрических атома углерода (С-5, С-6), что обусловливает существование четырех оптических изомеров, все они получены синтетически.
Кислота аскорбиновая представляет собой белый кристаллический порошок кислого вкуса. Она легко растворима в воде, растворима в спирте, нерастворима в эфире, бензоле и хлороформе. Температура плавления 190-193°С (с разложением).
Кислота аскорбиновая ведет себя, как одноосновная кислота. •Кислотный характер ее обусловлен водородом гидроксила в ■положении 3, за счет которого она образует соли.
Характерной частью молекулы кислоты аскорбиновой, обуславливающей ее химические свойства и физиологическую активность, является ендиольная группировка.
Благодаря подвижности водородных атомов енольных гидр-«оксилов кислота аскорбиновая легко окисляется, причем окисление может идти в две стадии.
1-я стадия. Характеризует обратимый процесс окисления, при котором кислота аскорбиновая окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты (кетонная форма), способной снова восстанавливаться до кислоты аскорбиновой.
2-я стадия. В водной среде процесс окисления может идти дальше — до разложения дегидроаскорбиновой кислоты. В этом ■случае продукты разложения не могут снова превратиться в
кислоту аскорбиновую, что характеризует необратимый процесс-окисления с потерей физиологической активности.
Важным свойством для проявления физиологического действия кислоты аскорбиновой является обратимый процесс ее окисления до дегидроаскорбиновой кислоты, т. е. окислительно-восстановительная способность кислоты аскорбиновой. В этом» случае она может быть донором, т. е. отдавать два атома водорода, окисляясь при этом в дегидроформу, и может быть акцептором водорода, т. е. принимать его, превращаясь в еноль-ную форму. Вследствие обратимости этих процессов кислота’ аскорбиновая может служить переносчиком водорода в ферментативных системах и, следовательно, участвовать в окислительно-восстановительных процессах организма. Учитывая эту важную физиологическую роль кислоты аскорбиновой в 1-й стадии’ окисления, чтобы задержать дальнейший процесс его, при изготовлении растворов аскорбиновой кислоты для инъекций к ним добавляют различные стабилизаторы, например, гидросульфит натрия и другие, при этом обеспечивают необходимые условия хранения этих растворов (отсутствие света, соприкосновения с металлами, особенно солями железа).
Для определения подлинности кислоты аскорбиновой используется ее способность к окислительно-восстановительным’ реакциям:
а) при действии на кислоту аскорбиновую раствором нитрата серебра происходит восстановление серебра (темный осадок); сама же кислота аскорбиновая окисляется и превращается в кетоформу;
б) при действии на кислоту аскорбиновую раствором 2,6-ди-хлорфенолиндофенола (окрашенного в синий цвет) последний» восстанавливается, превращаясь в бесцветное лейкооснование.
Кроме этих двух реакций, рекомендуемых ГФ X, можно привести еще целый ряд реакций, основанных на восстановительных свойствах кислоты аскорбиновой:
— с реактивом Фелинга окисная медь восстанавливается до закиси меди красного цвета;
— с раствором перманганата калия, происходит обесцвечивание раствора вследствие восстановления иона Мп04
— с феррицианидом калия в присутствии разведенной хлороводородной кислоты, с последующим добавлением раствора хлорида железа (III), образуется берлинская лазурь, окрашивающая раствор в синий цвет;
— кислота аскорбиновая с солью двухвалентного железа образует аскорбинат железа, окрашенный в фиолетовый цвет.
Методы количественного определения кислоты аскорбиновой также базируются на ее химических свойствах.
ГФ X рекомендует йодатометрический метод. В этом случае титрантом служит раствор йодата калия. Титрование ведут в присутствии йодида калия и хлороводородной кислоты (индикатор- крахмал) до стойкого синего окрашивания.
Количественное определение содержания кислоты аскорбиновой в растворах проводят также йодометрически, но здесь надо учитывать то обстоятельство, что в растворах кислоты аскорбиновой присутствует стабилизатор — гидросульфит натрия NaHS03> который как восстановитель может реагировать с йодом. Поэтому предварительно к раствору кислоты аскорбиновой добавляют раствор формальдегида (формалин). Последний связывает гидросульфит натрия и, таким образом, йод затрачивается только на окисление кислоты аскорбиновой.
Кислота аскорбиновая может определяться количественно и методом нейтрализации, как одноосновная кислота.
Изменение в структуре молекулы кислоты аскорбиновой приводит либо к уменьшению, либо к потере витаминной активности.
Значительно снижает или полностью уничтожает физиологическую активность кислоты аскорбиновой увеличение числа углеродных атомов в молекуле.
В настоящее время известно более десятка изомеров и аналогов кислоты аскорбиновой, являющихся ее антагонистами.
Среди известных антивитаминов кислоты аскорбиновой наиболее сильными являются D-аскорбиновая кислота (I) и D-глю-
коаскорбиновая кислота (II), имеющая в молекуле на один атом углерода больше, чем в молекуле кислоты аскорбиновой.
В кристаллической форме кислота аскорбиновая устойчива, но в водных растворах быстро окисляется и теряет свою биологическую активность, особенно в присутствии воздуха, следов металлов (вследствие катализа), в щелочной или кислой среде. Первым признаком разрушения кислоты аскорбиновой является возникновение желтого оттенка.
Применяют внутрь, внутримышечно и внутривенно. Выпускается в виде порошка, таблеток по 0,05 г и в ампулах по 1 и 5 мл 5% раствора.
Кислоту аскорбиновую часто применяют в комбинации с глюкозой (таблетки аскорбиновой кислоты с глюкозой), рути-ном (аскорутин). Она входит в состав поливитаминных препаратов.
Способ идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты
Владельцы патента RU 2581456:
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, изделий пищевой, химической и косметологической промышленностей по содержанию аскорбиновой кислоты и может быть использовано в фармацевтической, химической и косметологической отраслях промышленности. Способ идентификации, определения степени чистоты и количественного содержания аскорбиновой кислоты с использованием высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Способ отличается возможностью количественной интерпретации данных ТСХ аскорбиновой кислоты на офисном компьютере. Использование двух калибровочных кривых в способе позволяет значительно расширить область его применения (контроль качества как субстанции и монокомпонентных лекарственных форм витамина С, так и лекарственного растительного сырья, многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, изделиях пищевой, химической и косметологической промышленности). Способ отличается возможностью определения количественного содержания витамина С в образцах с низким его содержанием, исключая процедуру концентрирования растворов, ввиду большой чувствительности обнаружения аскорбиновой кислоты. Предложенный в способе реагент позволяет работать с водными извлечениями из лекарственного растительного сырья, которые содержат целый комплекс биологически активных веществ, и селективно определять содержание аскорбиновой кислоты в образце. Техническим результатом является повышение точности, а также возможность одновременного определения подлинности, степени чистоты и количественного определения аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей и отделения аскорбиновой кислоты от других биологически активных веществ в одно- и многокомпонентных лекарственных препаратах, биологически активных добавках, лекарственном растительном сырье, изделиях пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности. 7 ил., 3 табл.
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья (ЛРС), изделий пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности по содержанию аскорбиновой кислоты, и может быть использовано в фармацевтической, химической и косметологической отраслях промышленности.
В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) в фармацевтическом анализе применяется для оценки подлинности и чистоты аскорбиновой кислоты в субстанции и в лекарственных формах 8. ТСХ, обладая всеми преимуществами хроматографических методов, находит широкое применение ввиду своей экспрессности, доступности, достаточной чувствительности, селективности и простоте выполнения анализа. Тем более, что разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластинок и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более низкое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного хроматографического анализа.
Известен способ определения аскорбиновой кислоты на приборе «Денситометр Сорбфил», оснащенном компьютерной обработкой данных [3], заключающийся в хроматографировании пробы на силикагелевых пластинках с люминофорным содержанием в системе ацетон — спирт метиловый — уксусная кислота (3:1:1). Условия разделения хроматограммы: температура 20-22°C, насыщение камеры парами подвижной фазы в течение 20-30 мин. Для обнаружения аскорбиновой кислоты на хроматограмме в способе используется детектирование в УФ-свете. (254 нм). Аскорбиновая кислота обнаруживается в виде темного пятна на ярко-зеленом флюоресцирующем фоне. Данный способ не лишен недостатков. Во-первых, детектирование зон при помощи УФ-света затрудняет сканирование хроматограмм и приводит к получению больших ошибок в результатах количественного определения. Во-вторых, способ не может быть использован для определения аскорбиновой кислоты в сложных многокомпонентных объектах исследования, так как УФ-свет не является специфичным детектором зон аскорбиновой кислоты (табл. 1), что может приводить к обнаружению других посторонних веществ на хроматограммах с близкими значениями величины Rf. Кроме того, в способе в состав элюента входит высокотоксичный растворитель — метанол, пары которого негативным образом отражаются на здоровье специалистов, выполняющих определение по данной методике, что также можно отнести к недостаткам данного способа — аналога.
Известен способ определения аскорбиновой кислоты на приборе «Видеоденситометр Сорбфил», оснащенном компьютерной обработкой данных, в траве бурды плющевидной [1], заключающийся в хроматографировании пробы на силикагелевых пластинках «Sorbfil ПТСХ-П-В» в системе н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4:1:1). Для обнаружения аскорбиновой кислоты на хроматограмме в способе используется 0,01 М водный раствор серебра нитрата. Аскорбиновая кислота обнаруживается в виде темно-серых пятен на белом фоне. Данный способ характеризуется недостатками. Детектирование зон при помощи водных растворов приводит к растворению и частичному отслоению слоя силикагеля от подложки пластины, поэтому не рекомендуется использовать водные детектирующие реагенты для обработки хроматограмм [11]. Во-вторых, в способе на хроматограммах получают зоны аскорбиновой кислоты величиной Rf=0,75, тогда как оптимальным для практической ТСХ является интервал значений Rf от 0,3 до 0,6 [11]. Способ не может быть использован для определения аскорбиновой кислоты в сложных многокомпонентных объектах исследования, так как серебра нитрат не является специфичным детектором зон аскорбиновой кислоты (табл. 1), реагируя со всеми веществами, способными окисляться, что может приводить к обнаружению других посторонних веществ на хроматограммах с близкими значениями величины Rf, а также завышению результатов анализа. Интенсивность окраски зон на хроматограммах после проявления нестабильна во времени и изменяется под воздействием солнечного света, что также сказывается на точности определения. Следует также отметить, что чувствительность обнаружения аскорбиновой кислоты на порядок ниже, чем в предлагаемом способе (табл. 1). Кроме того, в способе в качестве проявителя используется очень дорогостоящий и нестойкий серебра нитрат, что значительно повышает стоимость одного анализа, а следовательно, также является недостатком данного способа — прототипа.
В научно-фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих проводить определение подлинности, степени чистоты и количественного содержания аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей и отделения аскорбиновой кислоты от других биологически активных веществ (в том числе других органических кислот) с применением ТСХ, не обнаружено.
Задача изобретения: состоит в разработке способа определения подлинности, степени чистоты и количественного содержания субстанции аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей аскорбиновой кислоты с другими биологически активными веществами и стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, изделий пищевой, химической и косметологической промышленностей по содержанию аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной ТСХ.
Технический результат — повышение точности, а также возможность одновременного определения подлинности, степени чистоты и количественного определения аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей и отделения аскорбиновой кислоты от других биологически активных веществ в одно- и многокомпонентных лекарственных препаратах, биологически активных добавках, лекарственном растительном сырье, изделиях пищевой, химической и косметологической промышленности достигается тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде или этаноле с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» 5×10 см с алюминиевой подложкой ПТСХ-А-А в системе растворителей состава: этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15) с последующим детектированием хроматограмм 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (субстанция, монокомпонентные лекарственные формы) или 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (многокомпонентные лекарственные препараты, биологически активные добавки, лекарственное растительное сырье). Оптимальный объем пробы — 2 мкл спиртового раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 2 мг/мл. Причем время насыщения камеры парами элюента составляет 20 мин, время элюирования — 35 мин, а время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t≥80°С — 3-5 мин. Сразу же после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1 и 2) обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». В результате получают треки в координатах Rf — интенсивность (фиг. 3). Величина Rf аскорбиновой кислоты составляет 0,43±0,02. Содержание аскорбиновой кислоты (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, можно рассчитать по формуле 1 (в случае анализа многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, лекарственного растительного сырья) и 2 (в случае анализа субстанции, монокомпонентных лекарственных форм):
где S — значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer».
Изобретение проиллюстрировано графиками, чертежами, схемами, таблицами, где в таблице 1 представлена характеристика детектирующих реагентов для определения аскорбиновой кислоты в тонком слое сорбента. На фиг. 1 изображена калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов (0,15-0,45%) аскорбиновой кислоты (проявитель — 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия): 1-3 мкг; 2-4 мкг; 3-5 мкг; 4-6 мкг; 5-7 мкг; 6-8 мкг; 7-9 мкг. Объем пробы 2 мкл. Фиг. 2. демонстрирует вид калибровочной хроматограммы с серией стандартных растворов (0,05-0,40%) аскорбиновой кислоты (проявитель — 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты): 1-1 мкг; 2-2 мкг; 3-3 мкг; 4-4 мкг; 5-5 мкг; 6-6 мкг; 7-8 мкг. Объем пробы 2 мкл. На фиг. 3 дана аналоговая кривая стандартного раствора аскорбиновой кислоты. На фиг. 4 представлен градуировочный график для определения содержания аскорбиновой кислоты в области концентраций (0,15-0,45%). Проявитель — 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. На фиг. 5 изображен градуировочный график для определения содержания аскорбиновой кислоты в области концентраций (0,05-0,30%). Проявитель — 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты. Фиг. 6 демонстрирует вид хроматограммы извлечения из листьев крапивы двудомной после проявления 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (1-3 мкл; 2-5 мкл и 3-10 мкл извлечения). Вид хроматограммы извлечения из свежих плодов облепихи крушиновидной после проявления 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (1-10 мкл; 2-20 мкл извлечения) представлен на фиг. 7. В таблице 2 приведены результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечениях из лекарственного растительного сырья. Метрологическая оценка предложенной в способе методики представлена в табл. 3 (на примере плодов облепихи крушиновидной).
Способ идентификации и количественного определения глутаминовой кислоты реализуется следующим образом.
Навеску исследуемого препарата растворяют в воде или этаноле с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» 5×10 см с алюминиевой подложкой ПТСХ-А-А в системе растворителей состава: этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15) с последующим детектированием хроматограмм 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (субстанция, монокомпонентные лекарственные формы) или 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (многокомпонентные лекарственные препараты, биологически активные добавки, лекарственное растительное сырье). Оптимальный объем пробы — 2 мкл спиртового раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 2 мг/мл. Причем время насыщения камеры парами элюента составляет 20 мин, время элюирования — 35 мин, а время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t≥80°С — 3-5 минут. Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1 и 2) обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» В результате получают треки в координатах Rf — интенсивность (фиг. 3). Установлены линейные зависимости между содержанием аскорбиновой кислоты и площадью хроматографической зоны (фиг. 4 и 5) в диапазоне изучаемых концентраций (0,15-0,45% — проявитель — 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; и 0,05-0,40% — проявитель — 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты). По полученным результатам были построены градуировочные графики, иллюстрирующие эту зависимость (фиг. 4 и 5).
Данный способ позволяет не только получать на хроматограммах четкие зоны аскорбиновой кислоты округлой формы с оптимальным значением величины Rf, но и проводить разделение сложных смесей аскорбиновой кислоты с другими биологически активными веществами, а также оценивать ее количественное содержание в образцах.
Использование двух калибровочных кривых в способе позволяет значительно расширить область его применения. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов аскорбиновой кислоты и построенный на ее основе график зависимости площади зоны от концентрации вещества в пробе (фиг. 5) при использовании в качестве проявителя 5% раствора ФМК может использоваться в контроле качества субстанции и монокомпонентных лекарственных форм витамина С. Данный реагент не является специфическим для аскорбиновой кислоты и на хроматограммах проявляет и другие зоны сопутствующих веществ, что снижает качество картины разделения и затрудняет обработку полученных изображений. Однако, ввиду большей чувствительности ФМК (табл. 1), возможно определять количественное содержание витамина С в образцах с низким его содержанием или работать с более разбавленными растворами, исключая процедуру концентрирования растворов.
Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов аскорбиновой кислоты и построенный на ее основе график зависимости площади зоны от концентрации вещества в пробе (фиг. 4) при использовании в качестве проявителя 0,2% спиртового раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, может использоваться в контроле качества лекарственного растительного сырья, многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, изделиях пищевой, химической и косметологической промышленности. Данный реагент является специфическим для аскорбиновой кислоты и на хроматограммах не проявляет другие зоны сопутствующих веществ. Это позволяет работать с водными извлечениями из лекарственного растительного сырья, которые содержат целый комплекс биологически активных веществ, и селективно определять содержание аскорбиновой кислоты в образце.
Ошибка в определении концентрации аскорбиновой кислоты будет уменьшаться с увеличением «а» в уравнении y=ax+в, следовательно, применение градуировочного графика для определения содержания аскорбиновой кислоты, где а=12467 (фиг. 5) приводит к более точным результатам по сравнению с результатами, полученными по графику, представленному на фиг. 4, где а=9233,6. Наличие в регрессионном уравнении коэффициентов b, отличных от нуля и равных 1550,1 и 5460,2 говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркости окрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».
Способ позволяет проводить определение подлинности, степени чистоты и количественного содержания субстанции аскорбиновой кислоты и стандартизировать лекарственные препараты, лекарственное растительное сырье, изделия пищевой, химической и косметологической промышленностей по содержанию аскорбиновой кислоты и отличается достаточной чувствительностью (2·10 -6 г при проявлении пластин 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия и 4·10 -7 г при проявлении пластин раствором фосфорномолибденовой кислоты), экономичностью, доступностью и экспрессностью.
Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами.
Пример 1. Разработанный способ идентификации и количественного определения витамина С был апробирован на лекарственном растительном сырье листьев крапивы двудомной.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) измельченных листьев крапивы двудомной с размером частиц 1,0-0,5 мм помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 58 мл воды (с учетом коэффициента водопоглощения сырья) и выдерживают в течение 10 мин на кипящей водяной бане, затем охлаждают 45 мин, фильтруют через несколько слоев марли, отжимая ЛРС, и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Доводят объем извлечения водой до метки и перемешивают. Полученную суммарную вытяжку в количестве 3, 5 и 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа. Высота пробега элюента 8-9 см. Вид хроматограммы представлен на фиг. 6. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 6) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечении из листьев крапивы двудомной представлены в табл. 2.
Пример 2. Разработанный способ идентификации и количественного определения витамина С был апробирован на лекарственном растительном сырье плодов облепихи крушиновидной свежих.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) плодов облепихи разминают и помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 50 мл воды и выдерживают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, затем охлаждают в течение 10 мин, фильтруют через несколько слоев марли, отжимая ЛРС, и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Доводят объем извлечения водой до метки и перемешивают. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 и 20 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом. Высота пробега элюента 8-9 см. Вид хроматограммы представлен на фиг. 7. Сразу же после проявления хроматограмм пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 7) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечении из плодов облепихи крушиновидной представлены в табл. 2.
Способ идентификации, определения степени чистоты и количественного содержания аскорбиновой кислоты с использованием высокоэффективной тонкослойной хроматографии, характеризующийся тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде или этаноле с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» 5×10 см с алюминиевой подложкой ПТСХ-А-А в системе растворителей состава: этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15) с последующим детектированием хроматограмм 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (субстанция, монокомпонентные лекарственные формы) или 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (многокомпонентные лекарственные препараты, биологически активные добавки, лекарственное растительное сырье); оптимальный объем пробы — 2 мкл спиртового раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 2 мг/мл, время насыщения камеры парами элюента составляет 20 мин, время элюирования — 35 мин, а время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t≥80°С — 3-5 мин, после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зона аскорбиновой кислоты идентифицируется по характерному значению величины Rf в сравнении с достоверным стандартным образцом, а количественное содержание аскорбиновой кислоты (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, можно рассчитать по формуле 1 (в случае анализа многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, лекарственного растительного сырья) или формуле 2 (в случае анализа субстанции, монокомпонентных лекарственных форм):
где S — значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer».